Ik ben mijn wachtwoord vergeten

IDC - Virusdiagnostiek 2.0

Aanleiding
De bloembollen- en sierteelt ondervindt schade door plantenvirussen. Dit betreft directe schade in het gewas of eindproduct maar ook in toenemende mate schade door exportbeperkingen.  Het snel herkennen van de aard van de ziekteverwekker is van belang voor een snelle bestrijding. De Bloembollenkeuringsdienst (BKD) en Nak Tuinbouw hebben laboratoriumtoetsen ter beschikking voor de snelle herkenning van (bekende) virussen in diagnostiekmonsters. Onbekende virussen worden deels opgespoord via overdracht op toetsplanten of elektronenmicroscopie (EM) hetgeen tijdrovend onderzoek is. Ondanks diverse onderzoeksmogelijkheden stagneert deze diagnostiek vaak.

 

Door ontwikkeling van technieken in de laatste jaren zijn sequentieanalyses van DNA/RNA steeds toegankelijker en goedkoper geworden. Deze techniek analyseert plantenvirussen aan de hand van hun genoom (= genetische informatie). Een stap verder gaat Next Generation Sequencing (NGS). Hiermee kan door schaalvergroting snel en betaalbaar al het aanwezige RNA/DNA binnen één plant/bol geanalyseerd worden inclusief het RNA/DNA van eventueel aanwezige ziekteverwekkers. Deze technieken zullen ons enerzijds in de toekomst een snellere diagnostiek verschaffen en ondernemers nog betere mogelijkheden bieden virusvrij uitgangsmateriaal te selecteren. Aan de andere kant kan het buitenland deze technieken ook gebruiken en ons confronteren met aangetroffen ziekteverwekkers in Nederlandse bloembollen.

Business case Virusdiagnostiek 2.0
In deze BC van het IDC wordt in samenwerking met servicelaboratorium BaseClear gewerkt aan de introductie van NGS als diagnostiek-instrument in de regio en bij de keuringsdiensten. De techniek moet leiden tot snellere resultaten, nieuwe inzichten en een andere benadering van plantendiagnostiek. Het project draagt bij aan het opbouwen van een kennisinfrastructuur voor deze technologie en toepassing bij virusdiagnostiek. Hierdoor wordt de drempel voor gebruik van NGS verlaagd en kan het de kostprijs doen verminderen, waardoor NGS ook breder toepasbaar wordt voor diagnostiek in diverse sectoren. Virusdiagnostiek 2.0 moet leiden tot een beter waarschuwingssysteem en de beste selectiemogelijkheden van gezond uitgangsmateriaal. 
 

 
De gewassen Zantedeschia en Freesia zijn vatbaar voor redelijk veel virussen en niet alle virussen zijn gekarakteriseerd. Landen stellen importeisen voor virussen in deze gewassen en de normen worden regelmatig aangepast naar aanleiding van nieuwe incidenten. In samenwerking met enkele teeltbedrijven zullen BKD en Naktuinbouw materiaal met mogelijke virusbesmettingen verzamelen. Er is veel belangstelling vanuit het bedrijfsleven voor deze nieuwe toetsingstechniek, de betrokken bedrijven zullen nauw betrokken worden bij het ontwikkelproces. Naast deelname in de klankbord groep leveren zij aangetast plantmateriaal aan. Later in het traject kunnen zij kandidaatplanten aanleveren voor vermeerdering in een kwaliteitssysteem welke met gangbare toetsen virusvrij getoetst zijn. Diagnostiek via NGS levert dan een aanvullend bewijs dat de kandidaatplanten vrij zijn van bekende, maar ook nog onbekende virussen.
 
Tussentijdse stand van zaken - nov. 2014
BKD, Naktuinbouw en BaseClear hebben in de periode augustus-november ervaringen opgedaan voor de juiste monstervoorbewerking en bewaring van monsters. Reeds ingevroren biologisch materiaal bleek onvoldoende geschikt te zijn voor Virusdiagnostiek 2.0. Hierdoor moest er nieuw vers materiaal gezocht worden. Inmiddels zijn enkele cruciale technische problemen opgelost.

Virusdiagnostiek 2.0 wordt eerst getest door analyse van biologisch materiaal waarin bekende virussen aanwezig zijn. Tevens zijn diagnostiekmonsters met typische virussymptomen verzameld waarbij met reguliere diagnostiek geen oorzaak gevonden kon worden. Momenteel wordt de laatste hand gelegd aan de monstervoorbewerking van de eerste serie met tientallen monsters voor Virusdiagnostiek 2.0.

De sequentie-technologie die toegepast gaat worden, resulteert in vele miljoenen sequentiefragmenten van voornamelijk de plant en eventueel aanwezige ziekteverwekkers. Er is een database en zoekalgoritme opgesteld voor het efficiënt zoeken naar de sequenties van de plantenvirussen. Bij de vondst van een bekend of eventueel nieuw virus zal aanvullend onderzoek uitgevoerd worden om de juistheid van Virusdiagnostiek 2.0 te bevestigen.
In overleg met Anthos en enkele betrokken ondernemers zijn goede afspraken gemaakt over de vertrouwelijkheid van de eigendomsrechten van bedrijfsgebonden resultaten die Virusdiagnostiek 2.0 oplevert.
 
Eindresultaat - Vakbladartikel in Bloembollenvisie - maart 2016 
Keuringsdiensten kunnen speld in hooiberg vinden
 
Snellere preventieve maatregelen bij vondst nieuwe virussen.
 
Door het steeds internationaler opereren van bedrijven en de schaalvergroting in de sector komen de telers en keuringsdiensten steeds vaker in aanraking met nieuwe en onbekende ziekten en plagen. Met name de identificatie van onbekende virussen in een gewas kan erg tijdrovend zijn waardoor soms kostbare tijd verloren gaat voordat de juiste preventie maatregelen genomen kunnen worden. Een goed voorbeeld hiervan is Plantago asiatica mozaïek virus (PlAMV) dat op het moment van identificatie in 2010 al was uitgegroeid tot een groot probleem voor de lelie sector.
            Het innovatie- en demonstratiecentrum (IDC) Bollen & Vaste planten biedt de mogelijkheid aan ondernemers in de Bollen- en Vaste Plantensector om kennis te nemen van nieuwe technologieën en innovatieve methoden via bundeling van krachten van verschillende organisaties . Een nieuwe technologie die wereldwijd binnen de medische- en groene sector sterk in opkomst is, is Next Generation Sequencing (NGS). Binnen één van de IDC projecten onderzoeken Naktuinbouw en BKD samen met Naturalis en het Leidse biotechnologiebedrijf Baseclear hoe deze technologie voor de Bollen- en Vaste Plantensector gebruikt kan worden. Anthos ondersteund een deel van de financiën van dit project. In dit project is de NGS-technologie geoptimaliseerd voor identificatie van bekende en onbekende virussen in diagnostiekmonsters.
 
Next Generation Sequencing
Genetisch materiaal bestaat uit een aaneenschakeling van bio-organische bouwstenen (nucleotiden) die samen de genetische code vormen. Het “lezen” ofwel sequencen van de volgorde van die bouwstenen gebeurt al sinds de jaren ’80 maar is zeer tijd- en arbeidsintensief. Recente technologische ontwikkelingen hebben geleid tot de ontwikkeling van Next Generation Sequencing (NGS). Met NGS worden in korte tijd data hoeveelheden gegenereerd vergelijkbaar met 40.000 foto’s, met als nadeel dat complexe analyses nodig zijn (zie bijlage onder aan deze pagina voor toelichting). De complexiteit van de NGS technologie is echter ook zijn kracht. In tegenstelling tot de huidige ELISA en PCR toetsen die altijd virusspecifiek zijn, richt de NGS techniek zich niet specifiek op één virus. Dit maakt NGS bij uitstek geschikt om onbekende of nieuwe ziekteverwekkers in een gewas te identificeren. Omdat de NGS technologie zowel bekende als onbekende ziekteverwekkers aantoont, kan NGS mogelijk ook gebruikt worden om een gewas ‘vrij van ziekteverwekkers’ te verklaren, wat met name voor uitgangsmateriaal een waardevolle toevoeging zou zijn in de sector.
 
Praktijkervaringen
Voor de optimalisatie van de NGS technologie en het schrijven van computer scripten voor het puzzelen, zijn verschillende gewassen zoals Tulp, Lelie, Zantedeschia, Dahlia, Canna en Freesia bemonsterd waarvan al bekend was welk virus erin aanwezig was. Na een uitgebreide optimalisatie zijn vervolgens de verwachte virussen aangetoond tussen het genetische materiaal van de plant. Deze laten zien dat de techniek toepasbaar is voor praktijkmateriaal.
            Naast het aantonen van bekende virussen levert de NGS analyse ook nieuwe informatie over een bekend virus. De genetische code van een virus verandert in de loop der tijd waardoor er soms een andere bouwsteen in het genetisch materiaal zit dan in de referentie code. Door deze veranderingen te kennen, krijgen de keuringsdiensten inzicht in hoe snel een virus verandert en wanneer er aanpassingen aan de virustoetsen nodig zijn. Dit soort kennis is cruciaal om altijd de beste toetsen beschikbaar te hebben en eventuele virusmeldingen uit het buitenland voor te blijven.
            Toen NGS geschikt bleek voor virusidentificatie zijn er ook diagnostiekmonsters geanalyseerd met virussymptomen waarvan de veroorzaker niet op voorhand onderzocht was. In deze planten zijn bekende virussen zoals Canna Yellow Streak Virus en Konjac mozaïekvirus geïdentificeerd. Ook bleek de NGS methode geschikt voor onderzoek aan 300 jaar oud plantmateriaal. Tijdens de tulpenmanie in de 17e eeuw werden tulpen met gevlamde patronen op de bloem verhandeld voor enorme geldbedragen. Alles wijst erop dat deze vlampatronen werden veroorzaakt door de aanwezigheid van een mozaïekvirus. Door het genetische materiaal van één van deze tulpen uit het “Van Royen” herbarium (Naturalis) met NGS te analyseren, weten we nu dat er inderdaad Rembrandt mozaïekvirus in deze 300 jaar oude tulp zat. Bovendien vertelt de genetische code van dit oude virus hoe en hoe snel dit virus veranderd is sinds de 18e eeuw tot en met anno 2016. Dit zijn leerzame voorbeelden van de toegevoegde waarde van NGS voor de kennisontwikkeling en toetsoptimalisatie.
            Tenslotte is er ook een plant geanalyseerd met onbekende virussymptomen waarin geen bekend virus kon worden aangetoond. Met behulp van specifieke software en handmatige optimalisatie van de analyse zijn de virus puzzelstukjes geïdentificeerd en aan elkaar gepuzzeld. Daarbij is een nieuw virus gevonden dat niet eerder beschreven is. De beschikbaarheid van de genetische code maakt het nu mogelijk om een PCR toets te ontwikkelend die dit virus voortaan aan kan tonen. De analyse van enkele andere diagnostiekmonsters is nog niet afgerond omdat virusidentificatie zonder referentie nog erg arbeidsintensief is. Bovendien kan het ook zo zijn dat er geen (bekend of nieuw) virus aanwezig is, en dat de symptomen een andere, bijvoorbeeld fysiologische oorzaak hebben. In dat geval levert het puzzelen  geen aanwijzing voor virus op.
 
Toekomst visie
Het is gebleken dat de NGS technologie zeer bruikbaar is om bekende virussen in planten te identificeren. Daarbij is de beschikbaarheid van kennis op het gebied van bioinformatica en virologie, goede software voor analyse en een goede uitgebreide virus referentie database van groot belang voor een vlotte identificatie van het virus. Op dit moment zijn er zo’n 1200 referentie codes van virussen beschikbaar maar dit aantal zal snel toenemen nu NGS wereldwijd wordt toegepast voor onderzoek en diagnostiek. NGS technologie maakt de identificatie van onbekende virussen in planten een stuk eenvoudiger. Voor deze analyses is echter specifieke kennis van de technologie noodzakelijk voor correcte virus identificaties. Daarbij moet bij de vondst van een nieuw virus altijd nog de correlatie gemaakt worden met de waargenomen symptomen. Bovendien zorgt de complexe analyse er momenteel nog voor dat het lastig is om een plant “vrij van virus” te verklaren omdat lage concentraties van een onbekend virus mogelijk nog niet tot goede identificatie leiden.
            De technologische ontwikkelingen met betrekking tot NGS en data verwerking zijn in volle gang waardoor de kosten dalen en NGS steeds toegankelijker wordt voor diagnostiek en (semi-)routine analyses. Maar om NGS breed inzetbaar te maken, moet er eerst een antwoord op een aantal vragen komen. Zo is nog onbekend of recente virusinfecties aangetoond worden en hoe gevoelig NGS is ten opzichte van ELISA en PCR toetsen. Daarnaast is nog onduidelijk hoe betrouwbaar de methode is bij een infectie met meer dan één virus. Tenslotte is een versnelde en gestandaardiseerde data verwerking noodzakelijk voor het routine matig toepassen van NGS voor virus identificatie in diagnostiekmonsters.
            Uiteindelijk zal de NGS technologie in Nederland, alsook in het buitenland ingezet gaan worden om bekende en onbekende virussen in gewassen op te sporen. Daarmee zal de kennis van virussen in gewassen toenemen. Hoe eerder de Nederlandse keuringsdiensten in staat zijn om voorop te lopen in deze kennisontwikkeling, hoe beter we onze exportgewassen vrij kunnen houden van virussen. Daarmee blijft de sector gezond en toonaangevend.
Tekst: Iris Stulemeijer (BKD)
Kader: Fleur Gawehns (Naktuinbouw)
 
Looptijd:voorjaar 2014 - eind 2015
Uitvoering: BKD, NAK Tuinbouw, Anthos en Baseclear
Contactpersoon: Maarten de Kock BKD
 

 

BijlageGrootte
PDF icon schematische_uitleg_ngs.pdf933.67 KB